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細(xì)胞重編程是指將分化細(xì)胞在特定的條件下逆轉(zhuǎn)恢復(fù)到多能性狀態(tài)的過(guò)程，為再生醫(yī)學(xué)提供干細(xì)胞資源。近年來(lái)，化學(xué)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（CiPSCs）擺脫了最初Yamanaka四因子誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPSCs）對(duì)外源基因?qū)氲囊蕾?，開(kāi)啟了對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)重編程認(rèn)知的新篇章【1，2】。然而到目前為止，CiPSCs仍無(wú)法通過(guò)干細(xì)胞多能性驗(yàn)證“金標(biāo)準(zhǔn)”——四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)證明其擁有與胚胎干細(xì)胞（ESCs）和iPSCs類似的發(fā)育潛能【3】。精原干細(xì)胞（SSCs）是哺乳動(dòng)物睪丸中的成體干細(xì)胞，具有自我更新和精子發(fā)生的能力。在體外培養(yǎng)條件下，小鼠SSCs可自發(fā)重編程為生殖細(xì)胞來(lái)源多能干細(xì)胞（SSC-iPSCs或gPSCs），是一種獨(dú)特的重編程現(xiàn)象，但其潛在的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變機(jī)制不明【4】。
2022年11月17日，南方醫(yī)科大學(xué)趙小陽(yáng)（中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)干細(xì)胞生物學(xué)分會(huì)委員）課題組，北京大學(xué)BIOPIC中心湯富酬（中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)理事）課題組和南方醫(yī)科大學(xué)汪妹課題組合作在Protein & Cell雜志上在線發(fā)表了題為The Chemical Reprogramming of Unipotent Adult Germ Cells towards Authentic Pluripotency and de novo Establishment of Imprinting的研究論文。該研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)首次系統(tǒng)描繪了小鼠SSCs自發(fā)重編程的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變路徑，針對(duì)重編程成功與障礙路徑特征進(jìn)行小分子篩選，建立獲得了可以使重編程效率提升約100倍的小分子化合物組合高效誘導(dǎo)體系（5C）。四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)證明5C誘導(dǎo)獲得的SSC-iPSCs具有與ESCs類似的發(fā)育潛能。重編程機(jī)制上，結(jié)合單細(xì)胞多組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組與DNA甲基化組）測(cè)序技術(shù)，本文首次發(fā)現(xiàn)SSCs重編程反向經(jīng)過(guò)類似體內(nèi)生殖細(xì)胞發(fā)育的主要路徑，即從精原細(xì)胞到原始生殖細(xì)胞（PGCs）再到上胚層細(xì)胞（Epiblasts）。在此過(guò)程中，全基因組和印記基因甲基化狀態(tài)也同時(shí)最終誘導(dǎo)的SSC-iPSCs無(wú)論全局DNA甲基化還是印記狀態(tài)都發(fā)生了整體重建，使SSCs這種成體干細(xì)胞完全重編程為具有完整發(fā)育潛能的多能干細(xì)胞獲得了類似于ESCs的表觀遺傳特征。該研究聚焦獨(dú)特的SSCs自發(fā)重編程現(xiàn)象，建立了可修復(fù)重編程系統(tǒng)缺陷導(dǎo)致發(fā)育障礙的高效誘導(dǎo)體系，其作用機(jī)理可能通過(guò)調(diào)控重編程過(guò)程中的關(guān)鍵表觀修飾狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)，為其他重編程體系的機(jī)制研究和再生醫(yī)學(xué)中功能干細(xì)胞的獲得提供了研究思路。
研究人員首先利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)繪制了小鼠SSCs重編程的全時(shí)程單細(xì)胞圖譜的細(xì)胞變化軌跡，鑒定了1條重編程成功和4條重編程失敗的路徑，通過(guò)比較重編程成功與障礙的路徑，通路富集分析發(fā)現(xiàn)糖酵解代謝、DNA甲基化/去甲基化等生物學(xué)事件特征在與成功重編程路徑中顯著激活密切相關(guān)。隨后針對(duì)這些特征進(jìn)行小分子化合物篩選，最終從183個(gè)小分子中獲得由5個(gè)小分子化合物組成的誘導(dǎo)組合（5C，Vitamin C、SGC707、 EGCG、TUDCA、Daphnetin），可將重編程效率顯著提高約100倍，并將重編程時(shí)程由19天縮短至10天。更讓人興奮的是，由5C誘導(dǎo)獲得的SSC-iPSCs在四倍體補(bǔ)償小鼠出生率、出生小鼠體重及存活率情況方面均優(yōu)于對(duì)照組。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)不同處理的SSC-iPSCs與ESCs進(jìn)行DNA甲基化測(cè)序，發(fā)現(xiàn)5C-gPSCs全局DNA甲基化、印記控制區(qū)（ICRs）甲基化、Dlk-Dio3區(qū)DNA甲基化水平更接近于ESCs，表明5C小分子組合不僅可以提高SSCs重編程效率，更具有修復(fù)多能干細(xì)胞表觀遺傳狀態(tài)與發(fā)育潛能的作用。
為進(jìn)一步探究5C體系對(duì)提升SSC-iPSCs發(fā)育潛能提升的調(diào)控機(jī)制，對(duì)該重編程過(guò)程中單個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞多組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)）測(cè)序發(fā)現(xiàn)SSCs重編程早期階段逆向經(jīng)過(guò)類似體內(nèi)生殖細(xì)胞發(fā)育的主要路徑，即與精原細(xì)胞到PGCs再到Epiblasts的擬發(fā)育軌跡高度擬合。這種發(fā)育軌跡的擬合不僅體現(xiàn)在成功重編程分支的細(xì)胞基因表達(dá)水平具有與體內(nèi)生殖細(xì)胞相似的表達(dá)特征，還獲得了生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中典型的全局DNA全基因組及印記基因甲基化擦除與重建的特征。值得一提的是，在重編程過(guò)程中，晚期階段，重編程早期被擦除的全局DNA甲基化獲得重建、SSCs部分母源印記基因ICRs特征（Igf2r、Snrpn、Peg3和Peg10等）建立，從哺乳動(dòng)物雄性生殖細(xì)胞SSCs中典型的ICRs雙等位低甲基化特征狀態(tài)經(jīng)過(guò)重編程轉(zhuǎn)變?yōu)镋SCs樣的單等位甲基化狀態(tài)，且5C小分子處理組高效體系有助于建立更接近于ESCs的全基因組和母源印記基因的甲基化特征在表觀重塑方面的優(yōu)勢(shì)更加突出，表明該研究建立的高效誘導(dǎo)體系不僅可以提高重編程效率，還具有修復(fù)多能干細(xì)胞表觀遺傳障礙與提升其發(fā)育潛能的作用。正確的重編程路徑及表觀特征對(duì)重編程誘導(dǎo)至關(guān)重要。
綜上，研究人員系統(tǒng)解析了獨(dú)特的SSCs（精原干細(xì)胞）自發(fā)重編程中的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變路徑，并利用全新的高效重編程系統(tǒng)修復(fù)了SSC-iPSCs的部分發(fā)育缺陷。該研究首次揭示了精原干細(xì)胞重編程經(jīng)過(guò)類似體內(nèi)生殖細(xì)胞逆發(fā)育路徑與印記重建的獨(dú)特機(jī)制。
南方醫(yī)科大學(xué)博士生陳雨寒、北京大學(xué)博士生盧健森、南方醫(yī)科大學(xué)許言文博士、黃亞萍博士和博士生王大壯為本文的共同第一作者。南方醫(yī)科大學(xué)趙小陽(yáng)教授、北京大學(xué)湯富酬教授和南方醫(yī)科大學(xué)汪妹教授為本文的共同通訊作者。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1093/procel/pwac044
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